2013年3月份，“H7N9”在上海和安徽率先發(fā)現(xiàn)，隨后在江蘇，浙江傳播蔓延。生物學(xué)家已經(jīng)檢測(cè)出這種病毒的結(jié)構(gòu)確認(rèn)其毒株了。北京熙縝隆博環(huán)?？萍加邢薰敬淼膬x器會(huì)成為您的*，歡迎有意購(gòu)買(mǎi)者撥打公司熱線電話010-68940148。

一、單鏈構(gòu)型多態(tài)性(SSCP)

作為檢測(cè)基因變異的手段已得到廣泛應(yīng)用，其原理是單個(gè)核苷酸的置換引起DNA單鏈構(gòu)象改變,在非變性電泳中足以導(dǎo)致泳動(dòng)率變化。

二、血清學(xué)檢測(cè)

2.1病毒中和試驗(yàn)（NT） 作為經(jīng)典方法，病毒中和實(shí)驗(yàn)操作繁瑣、耗時(shí)、費(fèi)料，臨床幾乎不用。

2.2血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)AIV 能夠與雞紅細(xì)胞發(fā)生凝集現(xiàn)象，這種紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象又可被特異性免疫血清所抑制，即紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)。血凝和血凝抑制試驗(yàn)可以鑒定病毒、檢測(cè)血清中的抗體水平。用抗不同血凝素的抗血清，由血凝抑制試驗(yàn)來(lái)確定HA亞型。

2.3神經(jīng)氨酸酶抑制（NI）試驗(yàn)微量神經(jīng)氨酸酶（NA）抑制劑抑制NA的活性，并以半抑制濃度IC50鑒定NA亞型。該方法成本低，適于大規(guī)模地應(yīng)用。

2.4瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP） 用于檢測(cè)AIV共同抗原核蛋白或基質(zhì)蛋白。由于所有的AIV 都具有型特異性共同抗原，用一種AIV的抗原或抗血清*可對(duì)所有AIV 的抗體或抗原進(jìn)行鑒定。免疫雙向擴(kuò)散及免疫電泳中以沉淀線判定可以定性，免疫單輻射擴(kuò)散試驗(yàn)可以定量。

2.5免疫熒光技術(shù)(IFT) 將抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，再進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。*早用于流感病毒是鑒定和定位病毒感染細(xì)胞中特異性的抗原、核蛋白(NP)或基質(zhì)蛋白(MP)抗原。用NP抗原的熒光抗體染色，主要出現(xiàn)核內(nèi)熒光；用MP抗原的熒光抗體主要出現(xiàn)胞質(zhì)熒光，核內(nèi)也可出現(xiàn)部分熒光。

2.7酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 運(yùn)用ELISA原理建立的AIV檢測(cè)方法較多，如用單克隆抗體介導(dǎo)的、經(jīng)生物素一親和素系統(tǒng)放大的H5亞型禽流感病毒捕獲ELISA檢測(cè)方法，為進(jìn)一步研究檢測(cè)試劑盒提供基礎(chǔ)。AIV抗體膠體金檢測(cè)試紙條則是膠體金免疫層析分析法，用純化病毒與膠體金顆粒偶聯(lián)，吸附在玻璃纖維上制作而成，不需要其他試劑,一步完成,反應(yīng)時(shí)間只需要幾分鐘(5～10min)，是一種檢測(cè)微量AIV抗體快速、簡(jiǎn)便的方法。

三、病原學(xué)檢測(cè)

雞胚分離培養(yǎng)是檢測(cè)病禽組織中AIV的一種經(jīng)典、準(zhǔn)確、敏感的病原學(xué)診斷方法，可以作為金標(biāo)準(zhǔn)，特異性和敏感度均可以達(dá)到*。

四、核酸擴(kuò)增方法

4.1RTPCR基于MP、NP 基因的高度保守區(qū)的引物，RTPCR可以鑒定AIV。為提高擴(kuò)增的靈敏度和特異性，也可采用巢式或半巢式RTPCR。

4.2多重RTPCR(mRTPCR)mRTRCR是在RTPCR基礎(chǔ)之上實(shí)現(xiàn)單管多檢的相對(duì)快速和經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法。

4.3Realtime RTPCR(RRTPCR)運(yùn)用特異性的熒光水解探針的RRTPCR方法可使檢測(cè)時(shí)間縮短為4 h。Lee等建立的檢測(cè)H5、H7亞型AIV的RRTPCR方法，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法比較，并以EID50（50%雞胚致病指數(shù)）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，呈正相關(guān)（r  = 0972），T 檢驗(yàn)無(wú)顯著差別（P >021）。其重復(fù)性試驗(yàn)呈正相關(guān)（r = 0902），靈敏度H5為1 fg或 10２ RNA拷貝，H7為10-1 fg或10 RNA拷貝，所測(cè)病毒濃度均低于1010 EID50，該靈敏度高于培養(yǎng)方法。

4.4依賴(lài)核酸序列的擴(kuò)增（NASBA）NASBA是一種快速、等溫的RNA 擴(kuò)增技術(shù)，整個(gè)反應(yīng)有賴(lài)于AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、T7 RNA 多聚酶和核酸酶H(RNase H)共同協(xié)作而完成，不需特殊儀器，不需溫度循環(huán)，是以轉(zhuǎn)錄為基礎(chǔ)，單鏈核苷酸的連續(xù)擴(kuò)增，其反應(yīng)產(chǎn)物是單鏈RNA。擴(kuò)增產(chǎn)物與磁珠上的捕捉探針及釕標(biāo)記的電化學(xué)發(fā)光寡核苷酸探針雜交后，形成復(fù)合物，經(jīng)NucliSens閱讀器直接檢測(cè)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。Collins等檢測(cè)了亞歐地區(qū)H5亞型AIV，同時(shí)還鑒別出高致病及低致病H5亞型。Lau 等建立的NASBA技術(shù)可以檢測(cè)H1～H15亞型的AIV，并能區(qū)分出H5及H7亞型，整個(gè)過(guò)程從核酸分離、擴(kuò)增、檢測(cè)在6 h 以?xún)?nèi)，靈敏度與雞胚培養(yǎng)相當(dāng)。

4.5環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增（loopmediated isothermal amplification, LAMP）    Poon等介紹了一種新的更加簡(jiǎn)便的擴(kuò)增方法，即環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增,特異性地針對(duì)6個(gè)獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物擴(kuò)增，以看家基因或外源性RNA分子作為陽(yáng)性對(duì)照。由于反應(yīng)中產(chǎn)生大量焦磷酸鎂，可以肉眼判斷結(jié)果，無(wú)需凝膠電泳。作者用該方法檢測(cè)了SARS病毒后，又檢測(cè)了H1～H3的AIV，與常規(guī)方法比較符合率為*。

五、基因芯片

將RTPCR獲得的cDNA固化于芯片，利用核酸探針技術(shù)構(gòu)建的檢測(cè)流感病毒A、B及其亞型的芯片平臺(tái)， Cy3、Cy5標(biāo)記的核酸探針與靶DNA雜交，可以進(jìn)一步鑒別混合體系中擴(kuò)增產(chǎn)物。Li等用cDNA芯片及mRTPCR對(duì)流感病毒進(jìn)行檢測(cè)及分型，結(jié)果顯示cDNA芯片為基于PCR的診斷技術(shù)提供了補(bǔ)充，因?yàn)榛赑CR的方法，直接從DNA擴(kuò)增片段大小不足以證明是目的產(chǎn)物。

病毒分離培養(yǎng)和血凝抑制試驗(yàn)經(jīng)常作為評(píng)價(jià)新的檢測(cè) AIV方法的對(duì)照，但病毒分離培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)，至少需7 d，不利于快速診斷，病毒分離的實(shí)驗(yàn)條件要求較高，同時(shí)有高致病性的危險(xiǎn)，對(duì)毒株的檢測(cè)及管理上要嚴(yán)格考慮生物安全措施。AIV在雞胚培養(yǎng)過(guò)程中還可能發(fā)生發(fā)生變異。血凝及血凝抑制試驗(yàn)特異性好，但其操作相對(duì)繁瑣，同時(shí)必須具備一定血凝效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)病毒和新鮮制備的紅細(xì)胞。血清學(xué)檢查對(duì)*后確診有回顧性診斷價(jià)值，一般只能在發(fā)病23周甚至更長(zhǎng)時(shí)間才能有抗體陽(yáng)性出現(xiàn)。由于 AIV 血清型眾多，新的變異株不斷出現(xiàn)，制備血清型特異性單克隆抗體相對(duì)困難，且在各種免疫接種的情況下，血凝抑制試驗(yàn)等血清學(xué)診斷方法也會(huì)失去作用。核酸擴(kuò)增技術(shù)（NAT）檢測(cè) AIV，選擇好靶基因和引物及優(yōu)化反應(yīng)參數(shù)，均可獲得高靈敏度和特異性。對(duì)于血清型眾多的 AIV，不同亞型致病性不同，宿主分布不同，故快速、特異地分型在 AIV 診斷中顯得尤為重要，而當(dāng)前的核酸擴(kuò)增技術(shù)尚不能高通量地鑒別出所有 HA 或 NA 的已知亞型。RTPCR 方法能夠獲得所有 AIV 的已知 HA 亞型，但*終結(jié)果尚需借助測(cè)序方法，不能作為常規(guī)檢測(cè)手段。要實(shí)現(xiàn)高通量、大規(guī)模的檢測(cè)，有望借助生物芯片這項(xiàng)技術(shù)。生物芯片正逐步應(yīng)用于細(xì)菌及病毒的檢測(cè)，它不僅能克服 PCR 擴(kuò)增技術(shù)中難題，對(duì) PCR 擴(kuò)增技術(shù)還能起到補(bǔ)充作用。目前人們針對(duì)病毒，甚至 AIV 檢測(cè)芯片不斷優(yōu)化雜交條件；將核酸擴(kuò)增產(chǎn)物片段化，以減少核酸二、三級(jí)結(jié)構(gòu)效應(yīng)對(duì)雜交的影響；以及對(duì)芯片載體結(jié)構(gòu)和檢測(cè)方法進(jìn)行改進(jìn)，都為建立快速、靈敏、特異的 AIV 檢測(cè)方法提供平臺(tái)。